Efecto antifibrótico de apremilast en fibroblastos dérmicos de esclerosis sistémica y modelo de ratón inducido por bleomicina

reactivos

TGF-β1 se adquirió de PeproTech (Rocky Hill, Nueva Jersey, EE. UU.). Apremilast se adquirió de AdooQ Bioscience (Irvine, CA, EE. UU.). Las sondas TaqMan se adquirieron en Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). Las sondas TaqMan utilizadas en nuestro experimento fueron las siguientes: Hs00164004_m1 (COL1A1), Hs00164099_m1 (COL1A2), Hs01026927_g1 (CTGF), Hs00426835_g1 (ACTA2), y NM_002046.3 (GAPDH). Pares de cebadores específicos para PDE4A-D se describieron en la tabla complementaria T1. Los anticuerpos principales utilizados para la transferencia Western fueron anticuerpos específicos para el colágeno tipo I (1310-01; Southern Biotech, Birmingham, AL, EE. UU.), Factor 2 de la red de comunicación celular (CCN2) (sc-14939; Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE. UU.), fosfo-AKT (4060; Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, EE. UU.), Akt (9272; Cell Signaling Technologies), fosfo-Erk1/2 (4370; Cell Signaling Technologies), Erk1/2 (4695; Cell Signaling Technologies Technologies), GAPDH (sc-25778; Santa Cruz), fosfo-Smad3 (9520; Cell Signaling Technologies) y Smad3 (9523; Cell Signaling Technologies). Los anticuerpos principales utilizados para la inmunohistoquímica fueron anticuerpos específicos para la actina alfa del músculo liso (αSMA) (14968; Cell Signaling Technologies), CD3 (ab5690; Abcam, Cambridge, Reino Unido) y F4/80 (ab111101; Abcam). La bleomicina fue proporcionada por Nippon Kayaku Co., Ltd. (Tokio, Japón).

Fibroblastos dérmicos

Se adquirieron fibroblastos dérmicos derivados de adultos sanos de Lonza (Basilea, Suiza) y Kurabo (Osaka, Japón). Los fibroblastos dérmicos derivados de pacientes con SSc se obtuvieron de las áreas lesionadas de los antebrazos. Debido a la falta de información detallada sobre los fibroblastos dérmicos comprados, no pudimos hacer coincidir el sexo y la edad entre los fibroblastos dérmicos derivados de controles sanos y los de pacientes con SSc. El diagnóstico de ES se realizó según los criterios de clasificación del Colegio Americano de Reumatología/Liga Europea Contra el Reumatismo de 2013.¹⁷. Todos los pacientes tenían el tipo cutáneo difuso dentro de los cinco años posteriores al fenómeno no de Raynaud en el momento de la biopsia de piel y no recibieron tratamiento con glucocorticoides ni inmunosupresores. En este estudio se utilizaron hasta cinco pases de fibroblastos dérmicos tanto de controles sanos como de pacientes con SSc. Los fibroblastos se incubaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal de ternera al 10% y penicilina/estreptomicina a 37 °C en CO2 al 5%.₂. El medio se reemplazó con DMEM sin suero 24 h antes de todos los experimentos. Para la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR), los fibroblastos se incubaron con apremilast 1–10 μM en presencia o ausencia de 10 ng/ml de TGF-β1 durante 48 h. Para la transferencia Western, los fibroblastos se incubaron con apremilast 10 μM en presencia o ausencia de 10 ng/ml de TGF-β1 durante 30 minutos para evaluar la transducción de señales y, de lo contrario, durante 72 h.

Medición de AMPc intracelular

Los niveles de AMPc intracelular se midieron utilizando un kit de inmunoensayo enzimático (EIA) disponible comercialmente (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE. UU.) como se describió anteriormente.¹⁸. Brevemente, 30 minutos antes del tratamiento, las células se trataron con 3-isobutil-1-metilxantina para eliminar los efectos de la actividad endógena de la PDE. Treinta minutos después del tratamiento, se recogieron lisados ​​celulares y se realizaron mediciones según las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa.

Para analizar la expresión de ARNm en fibroblastos dérmicos, se aisló el ARN total utilizando un kit disponible comercialmente (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se transcribió de forma inversa una cantidad igual de ARN total para sintetizar ADNc. El ADNc se mezcló con una mezcla maestra (Thermo Fisher Scientific) y cada cebador se aplicó a una placa por triplicado. La RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando sondas TaqMan en un sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 (Thermo Fisher Scientific). GAPDH sirvió como control interno, y la expresión de cada ARNm se calculó utilizando el método CT comparativo (ΔΔCT). la expresión de PDE4A-D El ARNm se cuantificó utilizando el sistema SYBR. Para la evaluación de PDE4A-D expresión, los productos amplificados por PCR se sometieron a electroforesis a través de gel de agarosa teñido con bromuro de etidio y se visualizaron usando un transiluminador.

transferencia Western

Los fibroblastos dérmicos cultivados se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces y se lisaron con tampón de lisis suplementado con inhibidores de proteasa en hielo. Las concentraciones de proteína se calcularon utilizando un kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific). Se aplicaron cantidades iguales de proteína en un gel de Tris-glicina al 4-20% (Thermo Fisher Scientific) y se separaron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida. Luego los geles se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de bloquear con leche desnatada al 5% durante 1 h, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche. Las membranas se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios. Las señales se visualizaron utilizando una solución electroquímica (Wako, Osaka, Japón). La densidad de la banda se calculó utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.).

Ratones

Los ratones BALB/c se adquirieron de Sankyo Labo Service Co., Ltd. (Tokio, Japón). El protocolo para desarrollar fibrosis dérmica inducida por bleomicina en ratones ha sido descrito previamente¹⁸. Brevemente, se disolvió bleomicina en 1 mg/ml de PBS y se esterilizó mediante filtración. Se afeitaron la espalda de ratones hembra de seis semanas de edad y se les inyectó por vía subcutánea 300 μl de PBS o una cantidad igual de bleomicina. Las inyecciones se repitieron cinco veces por semana durante cuatro semanas. Apremilast se disolvió en PBS a 1 mg/kg o 5 mg/kg y se inyectó por vía intraperitoneal al mismo tiempo que la inyección de bleomicina en el grupo de tratamiento con apremilast. Después de completar el protocolo, los ratones fueron sacrificados de acuerdo con las pautas del Comité de Revisión Ética de Experimentos con Animales de la Universidad Médica Femenina de Tokio, y se cortó la piel de la espalda. Las muestras de piel se fijaron en formaldehído al 10% y se incluyeron en parafina.

Evaluación histológica

El tejido incluido se seccionó con un espesor de 3 μm (MBL, Tokio, Japón; Sept Sapie, Tokio, Japón). Para evaluar el espesor dérmico, los portaobjetos se tiñeron con tinción tricrómica de Masson (MBL, Tokio, Japón; Sept Sapie, Tokio, Japón). Se midió la distancia desde la unión epidérmica-dérmica hasta la unión dermo-grasa. Se escanearon imágenes de portaobjetos teñidos y se calculó el espesor dérmico promedio de cinco campos seleccionados al azar con aumentos iguales utilizando el software ImageJ. Los portaobjetos estaban cegados al medir el espesor dérmico.

Inmunohistoquímica

Para el análisis inmunohistoquímico, las secciones se desparafinaron y se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% después de la recuperación del antígeno y se bloquearon con una solución de leche desnatada al 5%. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C y luego con anticuerpos secundarios durante 1 h. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-αSMA (1:200), CD3 (1:50) y F4/80 (1:200). Los anticuerpos se visualizaron utilizando el sistema DAKO EnVision (DAKO, Santa Clara, CA, EE. UU.). Las secciones se revelaron con tetrahidrocloruro de 3,3′-diaminobencidina dihidrato y se contratiñeron con hematoxilina. Las secciones fueron fotografiadas con un aumento de 100 ×. El número de células teñidas positivamente en las tres imágenes de piel se contó para cada grupo de ratones de forma ciega. Se utilizaron números de células positivas promediados para el análisis estadístico.

Contenido de colágeno

Recolectamos muestras de piel de ratones usando una punción de biopsia de 6 mm (KAI Industries, Gifu, Japón) y cuantificamos las muestras usando un kit de ensayo de colágeno total QuickZyme (QuickZyme Biosciences, Leiden, Países Bajos), siguiendo las instrucciones del fabricante.

análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). El Mann-Whitney Ud. Se utilizó una prueba para comparar los dos grupos. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post-hoc de Tukey para comparaciones de grupos múltiples. Los datos se analizaron utilizando el software estadístico JMP (versión japonesa 16, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.). p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Aprobación de ética

Este estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las directrices y regulaciones pertinentes. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Mujeres de Tokio (No. 3097-R). Todos los participantes fueron informados sobre el contenido de este estudio y se obtuvo su consentimiento informado por escrito. Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética de Experimentos con Animales de la Universidad Médica de Mujeres de Tokio (AE21-136) y se realizaron de conformidad con las pautas de ARRIVE.