Home Tecnología La nueva plataforma de detección genética integradora ofrece información sobre el papel de la accesibilidad del ADN en el cáncer

La nueva plataforma de detección genética integradora ofrece información sobre el papel de la accesibilidad del ADN en el cáncer

by notiulti

En un nuevo recurso para la comunidad científica, publicado hoy en Biotecnología de la naturaleza, investigadores del laboratorio de Neville Sanjana, PhD, en el Centro del Genoma de Nueva York (NYGC) y la Universidad de Nueva York (NYU) desarrollaron CRISPR-sciATAC, una nueva plataforma de detección genética integradora que captura conjuntamente las perturbaciones del gen CRISPR y la accesibilidad de la cromatina unicelular. en todo el genoma.

Con esta tecnología, perfilan los cambios en la organización del genoma y crean un atlas a gran escala de cómo la pérdida de enzimas que alteran la cromatina individuales impacta el genoma humano. El nuevo método aprovecha la capacidad de programación del sistema de edición de genes CRISPR para eliminar casi todos los genes relacionados con la cromatina en paralelo, ofreciendo a los investigadores conocimientos más profundos sobre el papel de la accesibilidad del ADN en el cáncer y en enfermedades raras que involucran la cromatina.

Los avances recientes en las tecnologías unicelulares han dado a los científicos la capacidad de perfilar la cromatina, el complejo de ADN y proteínas que reside dentro del núcleo de las células individuales. A la cromatina a menudo se le llama “guardián” del genoma porque sus proteínas actúan como elementos de empaque para el ADN, ya sea promoviendo o rechazando el acceso a él.

Esto controla los procesos de expresión génica en la célula, como activar o desactivar genes específicos. Los cambios en el panorama de la cromatina se han relacionado con diversos rasgos y enfermedades humanos, entre los que destaca el cáncer.

En una demostración inicial de CRISPR-sciATAC, el equipo de Sanjana Lab diseñó una biblioteca CRISPR para apuntar a 20 genes modificadores de cromatina que comúnmente están mutados en diferentes cánceres, incluidos los de mama, colon, pulmón y cerebro.

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Muchas de estas enzimas actúan como supresores de tumores y su pérdida da como resultado cambios globales en la accesibilidad de la cromatina. Por ejemplo, el grupo mostró que la pérdida del gen EZH2, que codifica una histona metiltransferasa, resultó en un aumento en la expresión génica en varios genes de desarrollo previamente silenciados.

La escala de CRISPR-sciATAC hace que este conjunto de datos sea único. Aquí, en un trasfondo genético uniforme, tenemos datos de accesibilidad que capturan el impacto de cada gen relacionado con la cromatina. Esto proporciona un mapa detallado entre cada gen y cómo su pérdida afecta la organización del genoma con la resolución de una sola célula “.

Dra. Noa Liscovitch-Brauer, coautora del estudio y becaria postdoctoral, Sanjana’s Lab, New York Genome Center y NYU

En total, el equipo se centró en más de 100 genes relacionados con la cromatina y desarrolló un “atlas de cromatina” que muestra cómo cambia el genoma en respuesta a la pérdida de estas proteínas. El atlas muestra que diferentes subunidades dentro de cada uno de los 17 complejos de remodelación de cromatina seleccionados pueden tener diferentes efectos sobre la accesibilidad del genoma.

Sorprendentemente, casi todos estos complejos tienen subunidades donde la pérdida desencadena una mayor accesibilidad y otras subunidades con el efecto contrario. En general, la mayor alteración en los sitios de unión del factor de transcripción, que son elementos funcionales importantes en el genoma, se observó después de la pérdida de la proteína 1A que contiene el dominio interactivo rico en AT (ARID1A), miembro del complejo BAF. Se estima que las mutaciones en las proteínas del complejo BAF están involucradas en 1 de cada 5 cánceres.

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Además del método CRISPR-sciATAC, el equipo también desarrolló un conjunto de métodos computacionales para mapear los movimientos dinámicos de los nucleosomas, que son los grupos de proteínas que envuelven el ADN. Cuando hay más nucleosomas, el ADN está fuertemente enrollado y menos disponible para unirse a los factores de transcripción.

Esto es exactamente lo que encontró el equipo en sitios de unión de factores de transcripción específicos involucrados en la proliferación celular después de la eliminación de CRISPR de ARID1A. Al apuntar a una enzima modificadora de cromatina diferente, estos mismos sitios experimentaron una expansión en el espaciamiento de nucleosomas, lo que demuestra la dinámica del posicionamiento de los nucleosomas en sitios específicos del genoma.

El método CRISPR-sciATAC permitió al equipo explorar sistemáticamente esta plasticidad del genoma para múltiples enzimas modificadoras de cromatina y sitios de unión a factores de transcripción.

“Realmente nos enfocamos en hacer de CRISPR-sciATAC una técnica accesible; queríamos que fuera algo que cualquier laboratorio pudiera hacer. Producimos la mayoría de las enzimas clave internamente y usamos métodos simples para el aislamiento de células individuales que no requieren microfluidos o kits unicelulares “, dijo el Dr. Antonino Montalbano, ex becario postdoctoral en el laboratorio de Sanjana en el New York Genome Center y NYU y co-primer autor del estudio.

Para desarrollar la tecnología CRISPR-sciATAC, los investigadores utilizaron una mezcla de células humanas y de ratón para crear un proceso de etiquetado / identificación que les permitió dividir y codificar los núcleos de las células, así como capturar los ARN de guía única necesarios para la selección de CRISPR.

El trabajo se basa en el trabajo previo de indexación combinatoria unicelular ATAC-seq (sciATAC-seq) del Dr. Jay Shendure en la Universidad de Washington y otros grupos que desarrollan nuevos métodos de genómica unicelular. CRISPR-sciATAC también utiliza una transposasa única y fácil de purificar que se desarrolló en el Laboratorio de Tecnología de Innovación de NYGC.

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Un obstáculo técnico clave fue optimizar las condiciones experimentales para capturar simultáneamente los ARN guía CRISPR y los fragmentos del genoma para el perfil de accesibilidad y, al mismo tiempo, mantener intacta la envoltura nuclear de cada célula.

“La integración de los perfiles de accesibilidad de la cromatina en las pantallas CRISPR de todo el genoma proporciona una nueva lente para que comprendamos la regulación genética”, dijo el Dr. Sanjana, miembro principal de la facultad, NYGC, profesor asistente de biología, NYU y profesor asistente de neurociencia y fisiología NYU Grossman School of Medicine, autor principal del estudio.

“Con CRISPR-sciATAC, tenemos una visión integral de cómo los complejos y enzimas modificadores de la cromatina específicos cambian la accesibilidad y organizan las interacciones que controlan la expresión génica. La cromatina prepara el escenario para la expresión génica, y aquí podemos medir el impacto de diferentes mutaciones en cromatina rápidamente. Esperamos que este atlas sea un recurso ampliamente útil para la comunidad y que CRISPR-sciATAC se utilice para producir atlas similares en otros sistemas biológicos y contextos de enfermedades “.

Fuente:

Referencia de la revista:

Liscovitch-Brauer, N., et al. (2021) Perfiles de los determinantes genéticos de la accesibilidad a la cromatina con pantallas CRISPR unicelulares escalables. Biotecnología de la naturaleza. doi.org/10.1038/s41587-021-00902-x.

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