Visualización fluorescente y evaluación de la absorción de colesterol mediada por NPC1L1 en los niveles de vesículas endocíticas

La absorción excesiva de colesterol de la luz intestinal contribuye a la patogénesis de la hipercolesterolemia, que es un factor de riesgo bien establecido para la enfermedad cardiovascular aterosclerótica. La absorción de colesterol intestinal está mediada principalmente por la proteína Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1), que es responsable de aproximadamente el 70 % de la absorción de colesterol. Los ratones deficientes en NPC1L1 son resistentes a la hipercolesterolemia inducida por la dieta, lo que proporciona una estrategia convincente para intervenir las enfermedades relacionadas mediante la inhibición de la expresión o la actividad de NPC1L1.

La proteína NPC1L1 se expresa en la membrana del borde en cepillo del intestino delgado. La proteína está extensamente N-glicosilada y compuesta de 1332 aminoácidos con 13 segmentos transmembrana, lo que dificulta la preparación de un anticuerpo ideal para analizar su comportamiento in vivo. Con base en los estudios que utilizan líneas celulares in vitro, se considera supuestamente que NPC1L1 media colesterol absorción por endocitosis mediada por clatrina. Sin embargo, esta noción también tiene algunos desafíos sin resolver. En realidad, las vesículas endocíticas de NPC1L1 con colesterol no se han demostrado en condiciones fisiológicas, ya que no existe una herramienta factible para visualizar y evaluar la endocitosis de las vesículas de NPC1L1 in vivo.

Utilizando la tecnología de edición de genes CRISPR/Cas9, los científicos de la Universidad Médica Naval de China generaron un modelo de ratón en el que la proteína endógena NPC1L1 se marcó con proteína verde fluorescente (EGFP). Los ratones NPC1L1-EGFP permitieron a los investigadores visualizar y evaluar con fluorescencia la endocitosis vesicular de NPC1L1-cago durante la absorción intestinal de colesterol. Este estudio fue publicado en línea en Metabolismo de la vida.

En este estudio, se encontró que los ratones knock-in homocigóticos NPC1L1-EGFP tenían una homeostasis normal del colesterol en condiciones de dieta “chow” o alta en colesterol. La fluorescencia de la fusión NPC1L1-EGFP proteína Se localiza en la membrana del borde en cepillo de las vellosidades más que en las criptas del duodeno, el yeyuno y el íleon, pero no en el colon. El patrón es consistente con las características de la distribución endógena de NPC1L1 en los ratones de control. Las vesículas positivas para EGFP se visualizaron debajo de la membrana del borde en cepillo tan pronto como dentro de los 5 minutos, y alcanzaron su punto máximo a los 15 minutos después de la administración oral de colesterol.

Es de destacar que las vesículas se colocalizaron con el marcador endosomal temprano EEA1 y el colesterol libre teñido con filipina, y la sonda de colesterol desencadenó la acumulación de vesículas positivas para EEA1 debajo de la membrana del borde en cepillo. El tratamiento previo con el inhibidor de NPC1L1, ezetimiba, inhibió la formación de estas vesículas endocíticas inducidas por el colesterol, lo que respalda aún más que la endocitosis vesicular está involucrada en la absorción de colesterol mediada por NPC1L1.

Este estudio, por primera vez, demuestra claramente el colesterol libre en vesículas endocíticas NPC1L1 durante la absorción intestinal de colesterol en condiciones fisiológicas. Proporciona una herramienta factible para evaluar la endocitosis vesicular de cargas de NPC1L1, así como la absorción de colesterol in vivo en condiciones fisiopatológicas y farmacológicas, y puede utilizarse en el descubrimiento de fármacos.

Además, dado que NPC1L1 también media la absorción intestinal de esteroles no colesterol como fitoesteroles y tocoferol, este modelo de ratón también es beneficioso para aquellos investigadores en el campo de la sitosterolemia y la deficiencia de vitamina E.