Dos proyectos de investigación financiados por el Centro para la Seguridad de los Productos Frescos (CPS) están explorando nuevas formas de mejorar los métodos de detección del virus de la hepatitis A (VHA) en los alimentos, aumentando su sensibilidad, reduciendo los falsos positivos y haciéndolos más rápidos y asequibles.
Actualmente, la utilidad de los métodos estándar de detección de virus para indicar el riesgo real de seguridad alimentaria que presenta el VHA es limitada, ya que estas pruebas a menudo arrojan resultados positivos basados en la presencia de fragmentos de ARN viral inactivos que no causan enfermedad.
Superando los Fragmentos Virales No Infecciosos con Pretratamientos Químicos
Para abordar esta limitación en los métodos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), un equipo de investigadores liderado por Lee-Ann Jaykus, Ph.D., Emerita de la Universidad de Carolina del Norte (NCSU) está explorando pretratamientos químicos de las muestras que evitarán que las pruebas de VHA detecten ARN inactivo. Benjamin Chapman, Ph.D. y Lynette Johnson, Ph.D., de la NCSU, colaboran con la Dra. Jaykus como coinvestigadores.
La primera técnica utiliza enzimas para digerir los fragmentos de ARN para que no puedan ser detectados mediante RT-qPCR. La segunda técnica emplea compuestos químicos que pueden ingresar a las cápsides, la cubierta proteica que protege el material genético del virus, y unirse al ARN para evitar la amplificación por PCR, que es el proceso de creación de copias del material genético específico para su detección y estudio.
Una vez optimizados estos pretratamientos, el equipo de la Dra. Jaykus los probará contra la única cepa de VHA cultivable en laboratorio, que se inactivará utilizando tratamientos químicos y térmicos, produciendo suspensiones virales con diferentes proporciones de fragmentos de ARN infecciosos y no infecciosos. A continuación, compararán los resultados de la RT-qPCR combinada con sus pretratamientos optimizados con los resultados de los ensayos de infectividad en cultivos celulares, aplicados a suspensiones de VHA totalmente infeccioso, parcialmente inactivado o totalmente inactivado. Finalmente, los investigadores probarán la eficacia de los pretratamientos de mejor rendimiento en un experimento utilizando frutas blandas inoculadas con diferentes proporciones de VHA infeccioso y no infeccioso, que se procesarán según la norma ISO.
Utilizando CRISPR-Cas para Pruebas Rápidas y Sencillas
En un segundo proyecto financiado por CPS, Jose Santos García Alvarado, Ph.D., de la Universidad Autónoma de Nuevo León en México, lidera un trabajo para desarrollar otro pretratamiento enzimático que destruya los fragmentos no infecciosos al tiempo que conserve la cápside infecciosa. Norma L. Heredia, Ph.D., de la Universidad Autónoma de Nuevo León, colabora con el Dr. García como coinvestigadora. Sus experimentos se centran en bayas congeladas, un vehículo importante de la enfermedad transmitida por alimentos por el VHA, y en el agua de riego, un factor de riesgo importante de contaminación de productos frescos.
Su equipo está investigando el uso del mismo pretratamiento enzimático en dos ensayos diferentes: uno que utiliza el método RT-qPCR estandarizado por la ISO y otro que reemplaza la etapa de amplificación de RT-qPCR con la tecnología CRISPR-Cas, similar a la utilizada para desarrollar las pruebas rápidas caseras de COVID durante la pandemia.
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A diferencia de la RT-qPCR, CRISPR-Cas no requiere equipos de laboratorio prohibitivamente caros ni técnicos especializados, explicó el Dr. García. Además, CRISPR-Cas puede producir resultados en tan solo 36 minutos, mucho menos que el tiempo de respuesta de dos horas requerido para la RT-qPCR.
El equipo del Dr. García está trabajando actualmente con laboratorios de la Universidad de Delaware y la Universidad de Emory, con la ayuda de Kalmia Kniel, Ph.D. y Juan León, Ph.D., respectivamente, para validar las nuevas técnicas. También tienen la intención de desarrollar un manual de usuario para los ensayos y esperan conseguir un socio de la industria para comercializar la prueba rápida de VHA.
