La colocalización del virus de la influenza A y los canales de calcio dependientes del voltaje proporciona nuevas perspectivas sobre el proceso de internalización en los cerdos

Declaración de ética

Los tejidos porcinos y murinos se originaron a partir de dos estudios experimentales.^27,28 aprobado por el Consejo Danés de Experimentación Animal (protocolo n.° 2020-15-0201-00502 y n.° 2012-15-2934-00256, respectivamente).

VDCC y IAV IHC

Inmunohistoquímicamente, Ca_vLos anticuerpos Pan α1 tiñen los genes α1 del Ca_v1 y Ca_v2 familias y, por lo tanto, se consideran un reactivo VDCC panreactivo. La secuencia de aminoácidos utilizada para producir el Ca._vEl anticuerpo Pan α1 corresponde a los aminoácidos 1506 a 1524 del Ca de rata._v1.2 y se comparó con las secuencias de aminoácidos correspondientes de Ca_v1.2 de origen porcino, ratón, humano, cobaya, hurón, pollo y pato.

Tejidos de corazón, nariz, tráquea y pulmón de cerdos de seis a siete semanas de edad (norte = 3, un cerdo de control y dos cerdos inoculados con IAV) para el examen inmunohistoquímico de VDCC, junto con tejido cerebral de un ratón adulto, que se utilizó como control positivo. Los tejidos fijados con formalina se incluyeron en cera de parafina y se cortaron en secciones de 2 a 3 µm. Las secciones se desparafinaron y después de cada uno de los siguientes pasos, las secciones se lavaron dos veces durante 5 minutos en solución salina tamponada con tris (TBS). Las secciones se bloquearon con peroxidasa endógena al 0,6 % (CAS: 7722-84-1, VWR International, Søborg, Dinamarca), se trataron previamente con tripsina al 0,1 % y se bloquearon con ultra v-block (TL-125-HLJ, Thermo Scientific). , Waltham, Massachusetts, EE.UU.). California_vSe añadió a las secciones el anticuerpo Pan α1 (ACC-004, Almone Labs, Jerusalén, Israel) diluido 1:2000 durante la noche a 4 °C. El método de detección fue el reactivo de polímero Ultravision ONE HRP (TL-125-HLJ, Thermo Scientific) que se agregó a las secciones durante 30 minutos. Se realizó un control de preadsorción como se describe anteriormente, pero mezclando el Ca_vPéptido bloqueador Pan α1 (BLP-CC004, Almone Labs) y Ca_vAnticuerpo Pan α1. Un control de isotipo (IgG) (X0903, Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE. UU.), diluido hasta el mismo contenido de proteína que el reactivo primario en albúmina sérica bovina (BSA)/TBS al 1%, en lugar de Ca_vTambién se realizó el anticuerpo Pan α1. La tinción se desarrolló agregando 3,3′-Diaminobencidina (DAB) durante 6 minutos, y las secciones se tiñeron con hematoxilina de Mayer (AMPQ00254.5000, VWR International, Radnor, Pensilvania, EE. UU.) y se montaron con glicerol-gelatina.

Se adquirieron al menos dos imágenes representativas de cada uno de los tejidos y compartimentos pulmonares (bronquios, bronquiolos y alvéolos). La lámina epitelial de la nariz, la tráquea, los bronquios, los bronquiolos y los alvéolos se seleccionó manualmente como región de interés (ROI) en ImageJ.²⁹. El porcentaje de píxeles por encima del umbral en el área seleccionada (% de área) se calculó utilizando el complemento “Color Deconvolution2” y estableciendo un umbral de 126 para hematoxilina y 120 para DAB.³⁰. El % de área de Ca_vPan α1 DAB se normalizó a hematoxilina (% de área de DAB/% de área de hematoxilina) y se restó el % de área del isotipo DAB normalizado a hematoxilina.

Se tiñeron secciones paralelas de dos cerdos infectados por IAV, inoculados con un IAV circulante en cerdos (adaptado a cerdos) y un IAV circulante en humanos (adaptado a humanos), para detectar IAV en la nariz, la tráquea y los tejidos pulmonares. Las secciones se desparafinaron y se bloquearon para la peroxidasa endógena como se describió anteriormente y en adelante se trataron previamente con 0,018 g de proteinasa (P8038, Sigma-Aldrich, Missouri, EE. UU.) diluidas en 100 ml de TBS durante 5 minutos. Además, las secciones se bloquearon durante 5 minutos con Ultra V Block (TA-125-UB, Epredia, Michigan, Estados Unidos) y anticuerpos anti-IAV (nucleoproteína (NP)) (HYB 340-05, SSI-antibodies, Copenhagen S. , Dinamarca) diluidos 1:50000 en BSA al 1 %/TBS se añadieron a las secciones durante la noche a 4 °C. Se añadió un potenciador de anticuerpos primarios (TL-125-PB, Epredia) a las secciones durante 20 minutos, seguido de un polímero HRP de gran volumen (TL-125-PH, Epredia) durante 30 minutos. La tinción se desarrolló agregando el vector AEC (SK-4200, Vector Laboratories, California, EE. UU.) durante 10 minutos y contratinción con hematoxilina de Mayer (AMPQ00254.5000, VWR International). Las secciones se montaron con glicerol-gelatina.

Cav.1.2 Transcriptasa inversa-qPCR

La presencia de Ca_v1.2, en tejido pulmonar congelado, obtenido de tres cerdos que habían resultado negativos para IAV, y en células T HEK 293. Las células T HEK 293 se utilizaron como control positivo para el ensayo de qPCR con transcriptasa inversa (RT-qPCR) ya que el Ca_vAnteriormente se han documentado 1,2 canales en estas celdas.¹⁸. Brevemente, se recogieron 200 µl de células T HEK 293 con medio esencial mínimo de Eagle (MEM) (Gibco) y se trataron como se describió anteriormente para hisopos nasales.³¹. Se añadió tampón RLT (QIAGEN, Hilden, Alemania) que contenía 2-mercaptoetanol (Merck, Darmstadt, Alemania) a 70 mg de tejidos pulmonares congelados, se lisó en TissueLyser LT (QIAGEN) a 30 Hz durante 3 minutos y se centrifugó a 9651 × gramo durante 3 min. La extracción de ARN se realizó como se describió anteriormente.³¹. La RT-qPCR se realizó utilizando el kit de RT-PCR de un solo paso de Qiagen (QIAGEN, Hilden, Alemania) con cebadores para Ca_v1.2 desarrollado por la ref. ¹⁸. Los ciclos de PCR fueron los siguientes: 50 °C por 40 min, 95 °C por 15 min y 45 ciclos de (94 °C 40 s, 60 °C 40 s, 72 °C 40 s) y 72 °C por 10 mín. El Ca amplificado_v1.2 fue detectado por SYBR verde.

Secuenciación Cav1.2 Sanger

El producto de RT-qPCR se purificó con un kit de purificación de productos de PCR de alta pureza (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) según el protocolo del fabricante. Los productos de PCR de uno de los tejidos de pulmón de cerdo junto con los cebadores (los mismos que se usan para la RT-qPCR) se enviaron para la secuenciación de Sanger en LGC Biosearch Technologies (Berlín, Alemania). Las secuencias resultantes se importaron al programa CLC Main Workbench versión 22.0 (QIAGEN, Hilden, Alemania) y se recortaron manualmente. Se ensamblaron las lecturas directa e inversa y se verificó la identidad de la secuencia consenso con las secuencias disponibles públicamente utilizando la herramienta BLAST contra NCBI Genbank. La secuencia se cargó en NCBI Genbank con el número de acceso OQ973297.

Hibridación in situ

Las secuencias consenso se utilizaron para crear sondas para elen el sitio hibridación para investigar el Ca_v1.2 expresión de ARNm en tejidos pulmonares porcinos ( norte= 1). Las secuencias de la sonda corresponden a los nucleótidos 3532–3625 (entre el exón 27 y el exón 28) en elcerda de cerdosubunidad del canal dependiente de voltaje de calcio alfa1 C/Ca_v1.2 (CACNA1C) predijo la secuencia de nucleótidos codificantes Genbank ID XM_021092981.1 y fueron solicitadas por Eurofins Genomics (Alemania GmbH). Las secuencias fueron las siguientes; sentido, 5′ GCT GGA CAA GAA CCA GCG GCA GTG ‘3 y antisentido, 5′ CAC TGC CGC TGG TTC TTG TCC AGC 3′. Las sondas se marcaron con fluoróforo CY3 en ambos extremos y se purificaron por HPLC. La hibridación in situ se realizó utilizando bastidores Shandon como se describió anteriormente con modificaciones menores.³². Las secciones se trataron previamente con proteinasa K al 10 % diluida en TBS (124568, Sigma-Aldrich, Missouri, EE. UU.) durante 10 minutos a 37 °C y se lavaron dos veces con agua Mili-Q después de la desparafinación. Para investigar la cantidad de señal autofluorescente en los tejidos porcinos, se realizó el método descrito anteriormente pero sin agregar las sondas. Las imágenes de los tejidos pulmonares porcinos se obtuvieron con un microscopio LSM 900 con un detector Airyscan2 acoplado y un objetivo de 40x/1,2. Todas las imágenes fueron adquiridas, procesadas y analizadas con el software ZEN utilizando la misma configuración para el canal CY3 en todas las imágenes. Las imágenes se analizaron en ImageJ de la misma manera que se describe para Ca_vPan α1 IHC pero utilizando la función de “canales divididos”, seleccionando la superficie de la lámina epitelial y estableciendo un umbral de 181 para DAPI y 6; 158 para el Ca_v1,2 sondas.