La reciente aprobación de una terapia CRISPR-Cas9 para la anemia de células falciformes demuestra que las herramientas de edición de genes pueden hacer un excelente trabajo eliminando genes para curar enfermedades hereditarias. Pero todavía no es posible insertar genes completos en el genoma humano para sustituir genes defectuosos o nocivos.
Una nueva técnica que emplea un retrotransposón de aves para insertar genes en el genoma es más prometedora para la terapia génica, ya que inserta genes en un “puerto seguro” en el genoma humano donde la inserción no alterará genes esenciales ni provocará cáncer.
Los retrotransposones, o retroelementos, son fragmentos de ADN que, cuando se transcriben en ARN, codifican enzimas que copian el ARN nuevamente en ADN en el genoma; un ciclo egoísta que satura el genoma con ADN retrotransposón. Alrededor del 40% del genoma humano está formado por este nuevo ADN “egoísta”, aunque la mayoría de los genes están desactivados, el llamado ADN basura.
La nueva técnica, llamada INserción precisa de transgenes mediada por ARN, o PRINT, aprovecha la capacidad de algunos retrotransposones para insertar de manera eficiente genes completos en el genoma sin afectar otras funciones del genoma. PRINT complementaría la reconocida capacidad de la tecnología CRISPR-Cas para desactivar genes, realizar mutaciones puntuales e insertar segmentos cortos de ADN.
El 20 de febrero se publicará en la revista una descripción de PRINT, que fue desarrollado en el laboratorio de Kathleen Collins, profesora de biología molecular y celular en la Universidad de California, Berkeley. Naturaleza Biotecnología.
PRINT implica la inserción de ADN nuevo en una célula utilizando métodos de administración similares a los utilizados para transportar CRISPR-Cas9 a las células para la edición del genoma. Para PRINT, una pieza de ARN entregada codifica una proteína retroelemento común llamada proteína R2, que tiene múltiples partes activas, incluida una nickasa; una enzima que une y corta el ADN bicatenario -; y la transcriptasa inversa, la enzima que genera la copia de ADN del ARN. El otro ARN es la plantilla para que se inserte el ADN transgén, más los elementos de control de la expresión genética -; un casete transgénico completo y autónomo que la proteína R2 inserta en el genoma, dijo Collins.
Una ventaja clave de usar la proteína R2 es que inserta el transgén en un área del genoma que contiene cientos de copias idénticas del mismo gen; cada uno de ellos codifica el ARN ribosómico, la máquina de ARN que traduce el ARN mensajero (ARNm) en proteína. Con tantas copias redundantes, cuando la inserción altera uno o unos pocos genes de ARN ribosómico, no se pasará por alto la pérdida de genes.
Poner el transgén en un puerto seguro evita un problema importante que surge al insertar transgenes a través de un vector de virus humano, que es el método común hoy en día: el gen a menudo se inserta aleatoriamente en el genoma, lo que desactiva genes funcionales o altera la regulación o función de los genes. , lo que podría provocar cáncer.
“Un enfoque basado en CRISPR-Cas9 puede reparar un nucleótido mutante o insertar un pequeño parche de ADN; fijar la secuencia. O simplemente se puede eliminar la función de un gen mediante mutagénesis específica del sitio”, dijo Collins, quien sostiene el Walter y Ruth Silla de la Familia Schubert. “No estamos anulando una función genética. No estamos arreglando una mutación genética endógena. Estamos adoptando un enfoque complementario, que consiste en introducir en el genoma un gen expresado de forma autónoma que produce una proteína activa; para volver a añadirlo “Un gen funcional como derivación del déficit. Es una suplementación transgénica en lugar de una reversión de mutaciones. Para corregir enfermedades por pérdida de función que surgen de una panoplia de mutaciones individuales del mismo gen, esto es fantástico”.
‘Los verdaderos ganadores fueron los pájaros’
Muchas enfermedades hereditarias, como la fibrosis quística y la hemofilia, son causadas por varias mutaciones diferentes en el mismo gen, todas las cuales desactivan la función del gen. Cualquier terapia de edición genética basada en CRISPR-Cas9 tendría que adaptarse a la mutación específica de cada persona. En cambio, la suplementación genética utilizando PRINT podría entregar el gen correcto a cada persona con la enfermedad, permitiendo que el cuerpo de cada paciente produzca la proteína normal, sin importar cuál sea la mutación original.
Muchos laboratorios académicos y nuevas empresas están investigando el uso de transposones y retrotransposones para insertar genes para terapia génica. Un retrotransposón popular que están estudiando las empresas de biotecnología es LINE-1 (Elemento 1 intercalado largo), que en los humanos se ha duplicado a sí mismo y a algunos genes autoestopistas para cubrir aproximadamente el 30% del genoma, aunque menos de 100 del retrotransposón LINE-1 de nuestro genoma. Las copias son funcionales hoy en día, una fracción minúscula del genoma.
Collins, junto con su colega postdoctoral de UC Berkeley Akanksha Thawani y Eva Nogales, profesora distinguida del Departamento de Biología Molecular y Celular de UC Berkeley e investigadora del Instituto Médico Howard Hughes, publicaron una estructura de microscopía crioelectrónica de la proteína enzimática codificada por el retroelemento LINE-1. el 14 de diciembre en la revista Naturaleza.
Ese estudio dejó claro, dijo Collins, que sería difícil diseñar la proteína retrotransposón LINE-1 para insertar de forma segura y eficiente un transgén en el genoma humano. Pero investigaciones anteriores que demuestran que los genes insertados en la región repetitiva del genoma que codifica el ARN ribosómico (el ADNr) se expresan normalmente sugirieron a Collins que un retroelemento diferente, llamado R2, podría funcionar mejor para la inserción segura del transgén.
Debido a que R2 no se encuentra en humanos, Collins y el investigador principal Xiaozhu Zhang y la becaria postdoctoral Briana Van Treeck, ambas de UC Berkeley, examinaron R2 en más de una veintena de genomas animales, desde insectos hasta el cangrejo herradura y otros eucariotas multicelulares, para encontrar una versión que estaba altamente dirigida a regiones de ADNr en el genoma humano y eficiente para insertar grandes longitudes de ADN en la región.
“Después de perseguir a docenas de ellos, los verdaderos ganadores fueron las aves”, dijo Collins, entre ellas el pinzón cebra y el gorrión de garganta blanca.
Si bien los mamíferos no tienen R2 en sus genomas, sí tienen los sitios de unión necesarios para que R2 se inserte eficazmente como retroelemento; Probablemente sea una señal, dijo, de que los predecesores de los mamíferos tenían un retroelemento similar a R2 que de alguna manera fue expulsado del genoma de los mamíferos.
En experimentos, Zhang y Van Treeck sintetizaron la proteína R2 que codifica el ARNm y un ARN molde que generaría un transgén con una proteína fluorescente expresada por un promotor de la ARN polimerasa. Estos fueron cotransfectados en células humanas cultivadas. Aproximadamente la mitad de las células se iluminaron en verde o rojo debido a la expresión de proteínas fluorescentes bajo luz láser, lo que demuestra que el sistema R2 había insertado con éxito una proteína fluorescente funcional en el genoma.
Estudios adicionales demostraron que el transgén efectivamente se insertó en las regiones de ADNr del genoma y que se podían insertar aproximadamente 10 copias del molde de ARN sin alterar la actividad de fabricación de proteínas de los genes de ADNr.
Un centro de biogénesis de ribosomas gigante
Insertar transgenes en regiones de ADNr del genoma es ventajoso por otras razones además de brindarles un puerto seguro. Las regiones de ADNr se encuentran en los brazos rechonchos de cinco cromosomas separados. Todos estos brazos rechonchos se agrupan para formar una estructura llamada nucleolo, en la que el ADN se transcribe en ARN ribosómico, que luego se pliega en la maquinaria ribosómica que produce proteínas. Dentro del nucléolo, la transcripción del ADNr está altamente regulada y los genes se reparan rápidamente, ya que cualquier rotura del ADNr, si se deja propagar, podría detener la producción de proteínas. Como resultado, cualquier transgén insertado en la región del ADNr del genoma sería tratado con guantes de seda dentro del nucléolo.
El nucleolo es un centro de biogénesis de ribosomas gigante. Pero también es un entorno realmente privilegiado para la reparación del ADN con un bajo riesgo oncogénico por inserción de genes. Es brillante que estos retroelementos exitosos -; Los estoy antropomorfizando -; han entrado en el ADN ribosómico. Es multicopia, se conserva y es un puerto seguro en el sentido de que puedes alterar una de estas copias y a la célula no le importa”.
Kathleen Collins, profesora de biología molecular y celular, Universidad de California, Berkeley
Esto convierte a la región en un lugar ideal para insertar un gen para la terapia génica humana.
Collins admitió que todavía se desconoce mucho sobre cómo funciona R2 y que quedan preguntas sobre la biología de la transcripción del ADNr: ¿cuántos genes de ADNr pueden alterarse antes de que la célula se preocupe? Debido a que algunas células desactivan muchos de los más de 400 genes de ADNr del genoma humano, ¿son estas células más susceptibles a los efectos secundarios de PRINT? Ella y su equipo están investigando estas cuestiones, pero también modificando las diversas proteínas y ARN implicados en la inserción de retroelementos para que PRINT funcione mejor en células cultivadas y células primarias de tejido humano.
Sin embargo, la conclusión es que “funciona”, afirmó. “Es sólo que tenemos que entender un poco más acerca de la biología de nuestro ADNr para poder aprovecharlo realmente”.
Otros coautores del Naturaleza Biotecnología El artículo son los estudiantes graduados de UC Berkeley Connor Horton, Jeremy McIntyre, Sarah Palm y Justin Shumate. El trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (F32 GM139306, DP1 HL156819, T32 GM07232) y la Fundación Shurl y Kay Curci. Collins solicitó patentes para PRINT y cofundó una empresa, Addition Therapeutics, para seguir desarrollando PRINT como terapia genética.
Fuente:
Universidad de California, Berkeley
Referencia de la revista:
Zhang, X., et al. (2024). Aprovechamiento de proteínas de retroelementos eucariotas para la inserción de transgenes en loci de puerto seguro humanos. Naturaleza Biotecnología. doi.org/10.1038/s41587-024-02137-y.
2024-02-20 16:33:00
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